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IHH4人甲狀腺乳頭狀癌細胞
復(fù)蘇
1. 把凍存管從液氮中取出來，立即投入37℃水浴鍋中，輕微搖動。液體都融化后（大概1-1.5分鐘），拿出來噴點酒精放到超凈工作臺里。
2. 把上述細胞懸液吸到裝10ml培養(yǎng)基的15ml的離心管中（用培養(yǎng)基把凍存管洗一遍，把粘在壁上的細胞都洗下來），1000轉(zhuǎn)離心5分鐘。
3. 把上清液倒掉，加1ml培養(yǎng)基把細胞懸浮起來。吸到裝有10ml培養(yǎng)基的10cm培養(yǎng)皿中前后左右輕輕搖動，使培養(yǎng)皿中的細胞均勻分布。
4. 標好細胞種類和日期、培養(yǎng)人名字等，放到CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞貼壁后換培養(yǎng)基。
5. 3天換一次培養(yǎng)基。
二、 細胞傳代
1. 培養(yǎng)皿中的細胞覆蓋率達到80%-90%時要傳代。
2. 把原有培養(yǎng)基吸掉。
3. 加適當?shù)囊鹊鞍酌福芨采w細胞就行），消化1-2分鐘。
4. 細胞都變圓后加如入等體積的含血清的培養(yǎng)基終止消化。
5. 用移液槍吹打細胞，把細胞都懸浮起來。
6. 把細胞吸到15ml的離心管中，1000轉(zhuǎn)離心5分鐘。
7. 倒掉上清液，加1-2ml培養(yǎng)基，把細胞都吹起來。
8. 根據(jù)細胞種類把細胞傳到幾個培養(yǎng)皿中。一般，癌細胞分5個，正常細胞傳3個。繼續(xù)培養(yǎng)。
三、細胞凍存
把細胞消化下來并離心（同上）。用配好的凍存液把細胞懸浮起來，分裝到滅菌的凍存管中，靜止幾分鐘，寫明細胞種類，凍存日期。4℃ 30min，-20℃ 30min，-80℃過夜，然后放到液氮灌中保存。
凍存液的配制： 70%的*培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO. DMSO要慢慢滴加，邊滴邊搖。
要注意的就是無菌操作！
IHH4人甲狀腺乳頭狀癌細胞
細胞培養(yǎng)常見問題及解決方法
問題 | 原因 | 解決方案 |
細胞生長緩慢 | 生長培養(yǎng)基使用不當 | 按照生產(chǎn)商的建議，使用相應(yīng)的預(yù)熱生長培養(yǎng)基。 |
生長培養(yǎng)基中血清質(zhì)量差 | 使用其他批次血清。 | |
傳代操作不當 | 按照生產(chǎn)商的建議消化時間及傳代比例進行操作。 | |
換液過于頻繁 | 降低換液頻率，參考生產(chǎn)商推薦的換液頻率。 | |
細胞傳代次數(shù)過多 | 使用傳代次數(shù)較少的健康細胞。 | |
細胞生長超過匯合狀態(tài) | 哺乳動物細胞傳代應(yīng)在細胞處于對數(shù)期、未達到匯合狀態(tài)時進行，建議細胞密度達 80-90%傳代。 | |
細胞被支原體污染 | 將細胞、培養(yǎng)基和試劑丟棄；新取一只凍存細胞，并且使用新的培養(yǎng)基和試劑。 | |
細胞復(fù)蘇存活率低 | 細胞凍存不當 | 新取一只凍存細胞，并儲存在液氮中。將細胞儲存在液氮中，直至復(fù)蘇。 |
自行制備的凍存細胞無活性 | 將細胞按照生產(chǎn)商推薦的密度凍存。 | |
制備凍存細胞時使用傳代次數(shù)少的細胞。 | ||
嚴格按照生產(chǎn)商推薦的操作程序凍存細胞。請注意本手冊推薦的冷凍程序是凍存細胞的一般流程，只能作為指導(dǎo)原則使用。 | ||
新取一只凍存細胞。 | ||
細胞復(fù)蘇方法不當 | 嚴格按照生產(chǎn)商推薦的操作程序復(fù)蘇細胞。請注意本手冊推薦的解凍程序是復(fù)蘇細胞的一般流程，只能作為指導(dǎo)原則使用。 | |
確保冷凍細胞解凍迅速，接種前用預(yù)熱的生長培養(yǎng)基緩慢稀釋細胞。 | ||
復(fù)蘇培養(yǎng)基使用不當 | 使用生產(chǎn)商推薦的培養(yǎng)基。確保培養(yǎng)基使用前已經(jīng)預(yù)熱。 | |
細胞稀釋過度 | 按照生產(chǎn)商的建議，將解凍后的細胞??密度接種，以改善復(fù)蘇效果。 | |
處理細胞時動作不夠輕柔 | 凍存和復(fù)蘇過程對大多數(shù)細胞都會造成不利影 響。不要通過渦旋振蕩或者用力敲打培養(yǎng)瓶的方法使細胞脫落(培養(yǎng)昆蟲細胞時除外)，也不要高速離心細胞。 | |
凍存液中所用保護劑在儲存過程中未避光 | 如果未避光儲存，凍存保護劑會轉(zhuǎn)變?yōu)閷毎卸拘缘奈镔|(zhì)；新取一只凍存保護劑，重新凍存細胞。 |
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